怎樣提取那麼小的病毒?
病毒的尺寸一般在幾十個納米,什麼樣的篩子能把病毒篩出來呢?
謝邀
我想題主的問題大概是「病毒那麼小,要如何從一大坨樣品里獲得純的病毒樣品?」
可以大致分解為下面方面
一般情況下,我們從樣品中分離病毒,並不使用物理的「篩」或「濃縮」的辦法,請參考此問題實驗室是如何分離生物病毒的?下的回答
簡單的說就是先通過各種手段圈定樣品中可能含有病毒種類的範圍
再用相應的細胞去培養
然後再收穫培養物里的病毒
當培養物里有雜質,如細胞碎片或細菌等,可利用病毒極小的特性,將培養物中的大體積物質篩掉,實驗室操作中我們一般採用0.22μm的濾器。
但有的時候,通過在細胞上繁殖病毒,也獲取不了我們需要的濃度的病毒,那麼就可以採用物理的方法來進一步濃縮病毒
比如超濾法超濾_百度百科(這也是最接近題主問題中「篩」這一概念的方法)
超濾法的關鍵是超濾膜,可以簡單理解為孔徑極小的篩子
當含有病毒的溶液通過超濾膜時,病毒就被留在了篩子上,而溶質和小分子物質如各種無機鹽等就被濾過了,之後再拿一定體積的液體把病毒從篩子上溶解下來,就實現了濃縮。
這是實驗室常用的一種超濾管,可用來濾100Kda以上的蛋白質或者病毒等。http://www.millipore.com/catalogue/item/ufc910024#
超濾法的局限在於
1.濃縮倍數有限,一般能濃縮20倍到50倍
2.當濾液中還含有其它尺寸大於濾膜孔徑的雜質時,會和病毒一起留在濾膜上。
所以當對濃縮倍數要求更高,或者要求獲取的濃縮病毒大分子雜質含量很低時,就可以選擇超離法 超速離心_百度百科了。
超速離心簡單說,就是利用變態的重力把含病毒溶液里的病毒甩下來。
在病毒純化時,我們常用的方法是密度梯度離心法
借用來源於網路的圖來說明一下http://refer.biovip.com/doc-view-1071.html
雖然該圖是講分離細胞器的,但原理是一樣的
首先,在離心管中按濃度低至高配置離心介質,如圖左所示的蔗糖
然後放到變態離心機里高速甩倆小時候
要分離的樣品里的物質就按密度排列在離心管里了
這時再按密度取出需要的條帶並重新溶解就好了。
其實是菜鳥,不過因為最近在包病毒收病毒上清做感染,所以來談談收病毒的慘痛經歷
我是使用轉染工具細胞with慢病毒包裝質粒以及帶有目的基因的慢病毒載體來產的病毒,
共轉染後收上清(aav除了上清還可以裂細胞收一部分)
然後我做過
1.超離 大致步驟就是細胞篩去除雜質和細胞碎片後將上清以25000rpm 4℃離心2-3小時,然後培養基重懸了分裝凍存使用 原理就不細講了,之前的前輩講得很清楚了;
2.超濾 也是去了碎片後利用超濾管將病毒濃縮到500ul左右,測滴度,分裝使用;原理就不講了,之前的前輩講得很清楚了(是有多懶
3.就是利用PEG8000分子過夜4℃均勻螯合病毒後,輕離心收沉澱;最近都是用的這個方法,
感覺效果不錯
要注意的都是滲透壓的問題;
此外,病毒實驗還是真真多小心。
之前自己曾出現過不在意,不穿白大褂不戴口罩開著風機收病毒導致了晚上難受嘔吐的事情
T^T
以上
給樓主一種具體的操作過程,也是 @譚大毛 提到的第一種方法。
PRRSV(豬繁殖與呼吸障礙綜合征,俗稱藍耳病)的分離純化
取發病豬的肺、脾或淋巴結,剪碎後液氮凍實,研磨、勻漿,然後用緩衝液重懸,反覆凍融,離心取上清,微孔濾膜過濾除菌,接種綠猴腎細胞系(絕大多數豬病毒無法感染並複製,PRRSV可以),細胞出現死亡後收集細胞和上清,反覆凍融,離心取上清,繼續接種細胞,連續接種3~5代後,上清中就只有純的PRRSV了。
手機打字,過程只是略述。
就本人淺薄的了解就是,收病變組織樣本,血液啊,組織,體液什麼的,然後該破碎的破碎,該凍融的凍融,再接種相應的敏感細胞,讓病毒擴增,然後收穫病毒,就是擴增,超濾,梯度密度離心之類的,然後就得到純的病毒了。
學識太淺,又愛亂說兩句,所謂半瓶水咣當響,見諒!
用過蔗糖梯度離心。
推薦閱讀: