科學家是用怎樣的實驗方法分辨出在蛋白質胞內轉運起效應的膜蛋白的？

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謝邀。
簡單答一下吧。先介紹下他們文章里用的方法，由於年代久遠估計好多目前都不怎麼使用了。以後有空了再補充下目前trafficking一般的研究手段。
另外，我想這個，去看看原文就能知道答案了，我幫你們搬運下好了。
主要是根據The 2013 Nobel Prize in Physiology or Medicine這個裡面給的「Key publications」來的。
第一篇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC383491/
主要是通過電鏡觀察一個酵母的溫度敏感分泌缺陷突變體（sec1-1），發現其在37度時有大量「internal pool of the secretory enzymes invertase and acid phosphatase」積累，此時出現「a large increase in the number of intracellular membrane-bound vesicles」，細胞回到允許溫度後這些vescile隨同這些酶就會被分泌出去，與「a vesicle intermediate in the yeast secretory pathway「的相應證據是一致的，」and suggest that exocytosis may contribute to cell-surface growth.」
結論：主要是電鏡觀察小泡形態+突變體。
第二篇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6498939
作者們在cell-free的系統中通過測量3H-N-acetylglucosa-mine (GlcNAc)的coupled incorporation來觀測"Transport of the VSV-encoded glycoprotein (G protein) between successive compartments of the Golgi "。下圖為示意，摘自原文。

結論：通過作者自己構建的體外系統，利用同位素標記的底物來示蹤，同時還測了酶活的好像。

結論：通過作者自己構建的體外系統，利用同位素標記的底物來示蹤，同時還測了酶活的好像。
第三篇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2188733
通過電鏡觀察一堆突變體，「sec18, sec17, and sec22, accumulate 50 nm vesicles at the nonpermissive temperature.」「These interactions suggest cooperation between different SEC gene products in vesicle budding and vesicle fusion processes.」
第四篇http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2333096
發現p65的胞內端長得像PKC，並且能和酸性磷脂結合。「The structure and properties of p65 suggest that it may have a role in mediating membrane interactions during synaptic vesicle exocytosis.」
具體是先離心synaptic vesicles，再做chromatography，然後SDS-PAGE得到p65蛋白，測蛋白質序列，據此設計引物PCR其cDNA，做個比對，測測一些諸如與脂類結合的性質。從這篇開始，總算有廣大生物民工耳熟能詳的玩意了。
第五篇SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion
用SNAREs拉in vivo的蛋白，「An affinity purification procedure based on the natural binding of these proteins to their targets was used to isolate SNAP receptors (SNAREs) from bovine brain
. Remarkably, the four principal proteins isolated were all proteins associated with the synapse, with one type located in the synaptic vesicle and another in the plasma membrane, suggesting a simple mechanism for vesicle docking. The existence of numerous SNARE-related proteins, each apparently specific for a single kind of vesicle or target membrane, indicates that NSF and SNAPs may be universal components of a vesicle fusion apparatus common to both constitutive and regulated fusion (including neurotransmitter release), in which the SNAREs may help to ensure vesicle-to-target specificity.「拉下來的主要四個蛋白都是和突觸有關的，說明了SNAREs在定位目標方面的重要性和在小泡融合中起的中心作用。下圖為示意，摘自原文。

主要運用技術：protein affinity purification

主要運用技術：protein affinity purification
第六篇Synaptic vesicle fusion complex contains unc-18 homologue bound
to syntaxin
開始也是用GST-tagged HPC-1（cytoplasmic domains of syntaxin A）去拉蛋白，拉出一個線蟲里叫UNC-18的蛋白，然後通過truncation的辦法找了下UNC-18和syntaxin結合的區域。完善了運輸的細節。

總結：依靠突變體和蛋白質親和純化技術，找到有趣的基因，然後通過電鏡，同位素示蹤以及其他生化的手段觀測vesicle等的多少，位置和這些蛋白質的其他諸如酶活性之類的性質。如今做trafficking的應該或多或少能有high-throughput screening來找基因，live-imaging之類的觀測，以及其他目前普遍使用或者少數頂尖實驗室使用的技術來尋找蛋白質的功能吧。先到這兒。

下面是一些補充的參考文獻。
http://www.laskerfoundation.org/awards/pdf/2002_rothman.pdf
http://www.laskerfoundation.org/awards/pdf/2002_schekman.pdf
http://www.laskerfoundation.org/awards/pdf/2013_b_sudhof.pdf
Rapid Release Revealed: Honoring the Synapse
Cell - Rothman and Schekman SNAREd by Lasker for Trafficking
The Mechanisms of Vesicle Budding and Fusion

Zhou Ziliang 的回答已經很詳細的介紹了具體的實驗方法，我來補充一下實驗的設計思路吧。繼續使用他所提到的今年諾貝爾獎得主的例子，他們的研究領域正是細胞內轉運。另外盡量用簡單的說法，希望非生物專業的人也能看的明白。

Randy Schekman 教授的研究對象是Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）。單細胞真核生物，基因少（相對於人類），易操作（好養，好處理，實驗工具豐富啊），同時仍與人類細胞有很多的相似性。他的實驗思路可以說是一種「減法」。通過突變去除某個蛋白然後看它的影響。道理如同足球比賽你少派了一名隊員上場，發現對方進球很容易，怎麼射怎麼有，那麼沒上的那個傢伙很可能就是門將。生物研究通過基因突變去除某個特定的基因或者改變它的部分基因序列，那麼突變細胞就會缺少該基因所編碼的蛋白，或者蛋白仍存在但是缺失某些功能。

Schekman就是通過基因突變發現了很多與轉運相關的蛋白。當缺少這些蛋白時，突變細胞往往有某種轉運缺陷（比如因為轉運被停止，所以細胞內的膜結構載體聚集和增大），可以通過實驗手段觀察到（比如電子顯微鏡）。這種通過突變特定基因研究特定蛋白功能的方法至今仍然廣泛使用。

Schekman的實驗設計很精妙的，要知道那是80年代，還沒有酵母基因組的序列信息，也就無從而知它都有哪些基因。而且即便知道了基因序列信息，幾千個基因也不能挨個突變一個個試啊。所以他養了一堆細胞然後加入一種可導致突變的試劑，該試劑可以在隨機造成某個基因的變化。於是這堆細胞就變成了帶有不同的隨機基因突變的細胞群，之後就可以在其中篩選出有細胞轉運缺陷（傳遞某貨物非常無力）的突變細胞了。當然在當時他只是發現了這些突變細胞，並做了很多相關實驗。待之後基因序列信息的豐富和基因組測序技術的發展，具體這些突變細胞中是哪些個基因被突變了就知道了。

Schekman是通過改變細胞內的基因，是通過觀察細胞所發生的變化。James E. Rothman教授則是在cell free的情況下做的實驗，體現另一種思路。Schekman的實驗是觀察細胞內所發生的變化，實驗也使用的是活細胞（雖然許多實驗之前細胞已經速死了（fixed），但仍能體現生前形象，嗯，可按照龐貝古城想像），所以觀察的結果一般認為更能體現細胞內的真實情況。但細胞內系統複雜，背景噪音嘈雜，並受限於實驗設備的技術局限，有時候無法觀測的某些信息。另一方面，細胞外（cell free）的實驗，是把細胞內的一些組分提純出來，再用這些組分在實驗室條件下還原細胞內所發生的某種現象。比如你提純了組分A ，B， C，發現只有把他們都加到一起的時候才能起某種反應，（可以說是某種加法），那麼你就可以大概推測 A,B,C在這種反應中起作用。細胞外的實驗背景簡單，可用的實驗手段也更多。當然相對的，由於實驗環境與細胞內環境還是有很大差別的，所以某種程度上不能完全反映細胞內的真實情況。比如確實有在細胞外得出的結果，後來的研究發現在細胞內根本不一樣。所以研究中一般都會細胞內，細胞外的實驗同時進行，相互印證。

回到 Rothman的實驗，借了Zhou Ziliang 轉的圖然後稍微修改了下

簡單的說就是donor細胞再接受病毒感染後會產生一種VSV encoded G蛋白，這種G蛋白可以被糖基轉移酶修飾，但donor細胞中缺少這種酶。acceptor細胞中沒有這種G蛋白，但是有糖基轉移酶。Rothman從供體和受體細胞中提純了高爾基體（嗯，簡單說的說就是某種封閉的膜結構，）並把他們混到一起，然後觀測G蛋白有沒有被修飾，如果修飾發生了，就說明G蛋白轉移到了受體中，也就說明了轉運系統的存在。

簡單的說，其實就是，A有原料沒加工工具，B有工具沒原料，最後你能看到成品就說明原料從A運輸到了B。

今天剛聽了復旦物理系美女教授譚硯文的報告，超喜歡她！在她們的實驗過程中用的是這樣一種方法來觀察單分子蛋白質。利用DNA變異使得產生的目標蛋白質分子跟一種能發出熒光的蛋白質分子連接在一起，這樣這個蛋白質自身就會發出很弱的光，然後就可以利用光學的方法觀測這種蛋白質單分子。才疏學淺，不知有木有答到點上…

謝邀。高中的時候我可能還知道，現在不清楚了