養細胞有哪些經驗和教訓？
每天孝敬細胞比孝敬爹媽還用心，不知道大家在培養細胞時有哪些經驗教訓可以分享。
圍繞污染問題，包括細菌、支原體等污染及預防，其他答案已經說得很多了，我就不贅述。我就說一個如何把細胞養漂亮的經驗：
1、操作時間盡量短，操作步驟盡量少。無論是從培養箱拿出來，到trypsin消化，到離心等，這些對細胞來說，都屬於是stress。因此，我們要縮短整體的操作時間，減少操作步驟。
a）對於好消化的細胞來說，完全不需要將細胞消化到漂起來、加培養基終止後離心，可以在消化到差不多快要脫落的時候，移除大部分trypsin，稍候片刻，直接加培養基將細胞吹打下來，省去離心步驟。殘餘的trypsin由於含量很低，所以不會對細胞產生任何影響。
b）對於難消化的細胞，我倒是建議用無鈣鎂PBS洗滌一次後，加入稍微多一點trypsin置37度徹底消化至脫落（一晃細胞就掉下來的那種），然後再加培養基終止、離心。這麼做的道理是，細胞消化不徹底，勢必會增加吹打輔助脫落的次數。而吹打次數越多，細胞活性越差。
值得注意的是，有些特殊的細胞，不可以使用trypsin作為消化液。比如我有一株純由EGFRvIII基因驅動、不含其他生長因子信號通路基因突變的腫瘤細胞，用trypsin消化之後，形態會發生劇變，要等兩天才能恢復。經進一步實驗發現，原來是trypsin剪切了EGFRvIII（室溫2分鐘就幹掉20%的EGFRvIII）。而使用trypLE就不會有這種現象，相應地，流式數據提示僅丟失5%不到的信號。所以遇到比較脆的細胞，比如幹細胞和一些腫瘤PDC，要測試一下何種消化液可用。
2、明白每一種細胞對營養物質的需求。我看過無數protocol使用PBS做細胞重懸、染色等活細胞實驗的緩衝液。短時間的話，這並沒有什麼問題。但是，經典的PBS配方中並不含葡萄糖、氨基酸等營養物質。因此，細胞在PBS中待的時間長的話，活性會受到極大的影響。我曾經做過一個實驗，分別用PBS和HBSS（後者含葡萄糖）重懸同一份細胞樣品，上流式進行單細胞分選到96孔板。最後，HBSS組超過50%的孔長出克隆，而PBS組則低於5%。對於一些非常敏感的細胞來說，比如神經元，連洗滌都要使用含糖及其他營養物質的buffer。
這篇專欄文章最後附上了我的獨家緩衝液配方，可以讓細胞離開培養基和培養箱、待在室溫環境中幾個小時而完全不影響細胞活力（經Sytox Red染色驗證） 廉價的活細胞熒光實驗緩衝液 - 知乎專欄嚴格無菌操作，多噴噴酒精，要是對滅菌的東西不放心，自己包自己送自己烘乾。
不要和別人共用試劑耗材，自己準備一套。
有可能的話在拿到新細胞的時候做好支原體衣原體檢測。
水浴鍋很臟，生化培養箱要是得手動加濕的話盤裡的水也會很臟，勤換（滅菌水加進去）。
晚上離開的時候最好給細胞房照紫外，超凈台是用完就開吧。
最好的是同一時間就你一個人在用細胞房在養細胞。
初步就想到這麼多，雖然我準備轉碩閃人了，但一想起這些玩意，還是有回答問題的衝動。
養過一段時間的Hela和Siha，都是跟別人要的。分享一點經驗吧。
1、別怕浪費。槍頭什麼的只要有可能污染就換，如果用酒精燈就什麼都稍微烤一下，別直接放到火上，離一段距離。
2、動作要既輕柔又有力。動作太重會有一堆一堆的氣泡，動作太輕就吹不下來。。。剛開始的時候吹細胞太痛苦了，稍微一下就起泡。後來就是吹的時候槍里的培養基不要一次全都壓出來，留一點，槍的最頭部盡量深的在液面以下。
3、離開過操作台的東西再進操作台之前一定要用酒精噴一遍，包括一切實驗耗材、儀器、以及你帶著手套的手。
4、實驗結束後對實驗台的消毒。紫外什麼的，用前用後都照個30分鐘。
5、身體的各個部分盡量的少接觸不需要接觸的地方的地方。比如實驗台，又比如培養箱內部。
6、細胞的密度根據細胞的性質、傳代的時間以及自己的心情來定。培養基的話最多最多不要超過2天就要換一次。細胞可以不傳代，但是培養基是一定要換的。
大概就是，不該碰的地方不碰，有影響的地方少碰；該使勁的時候絕對不含糊，不該使勁的地方一定忍住。如果是比較簡陋的操作台就一定要擺個酒精燈，所有操作緊密圍繞在酒精燈周圍進行。如果是高級檯子就多用酒精噴噴。感覺生物的實驗，心疼錢就還是不要做了。。。
最後一點點絕對非科班的經驗。癌細胞真是堅挺。有一次實在是不想傳了，放了5天吧，感覺都長了幾層出來來，培養基都黃了。抱著試一試的心情傳了一次，又堅強的活過來了。。。當然，狀態肯定也差的很了。養了三年細胞，各種腫瘤細胞，大家的回答已經很全面了，稍微補充一點自己的看法：
1、我們實驗室細胞基本上都是在ATCC（ATCC: The Global Bioresource Center）買的，一個新細胞在養之前，可以看看ATCC上面說明的細胞特點，包括細胞正常生長的狀態圖、傳代、培養基的類型等。
2、不同細胞生長周期不同，有的生長很快，比如說MDA-MB-231，傳代的時候取離心懸液的十分之一就已經足夠了，有的又是特別慢，等的人心焦，BT474就是，傳代是一分二，復甦起始的時候兩周多才能長滿，所以就要在培養細胞的過程中多多摸索了。
3、對於嬌弱的細胞，就得細心呵護了，胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉速和時間，每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。
4、凍存細胞復甦後第二天最好更換一次培養基。
5、培養箱隔一段時間徹底用酒精棉擦洗一次。
6、養細胞最大的教訓：不能偷懶！！
個人經驗：
1、不管買的細胞、惠贈的細胞，剛拿到手趕緊的做兩件事：1、檢測是否有支原體污染；2、迅速擴增凍存。
2、發現有污染迅速處理掉，特別是當你養了很多種細胞時；細菌污染，真菌污染很容易發現，支原體污染的話，細胞會長的慢，買個支原體檢測的kit定期檢測一下。
3、細胞房日常的值日清潔是必須的，此外還要定期熏蒸。
4、細胞的傳代一定要規律，保持相同的confluency和傳代時間間隔，不要隨心所欲或者拖延...
5、個人衛生。
出各種玄學狀況的時候，實際上一般都是微生物污染，微生物不僅僅有大腸桿菌、酵母和幾種常見支原體，也不是所有微生物都讓培液渾濁的。救不了的，施主丟吧......
同時也把所有在同一個超凈台里用過的瓶子也都扔掉，酒精，DMSO和異丙醇除外。拿到細胞的時候多凍點，免得以後跳腳。
堅決不自己用粉末配培液、胰酶、PBS, 有太多的東西手工過濾不掉了。能不用移液槍就不用，槍桿上髒得很，我都用一次性塑料移液管。
支原體絕大多數來自操作者的口腔和鼻腔，除非一直戴口罩否則幾乎無法避免支原體污染緩慢積累，如果不用相應的抗生素就必須一直檢測。
支原體對酒精有一定抗性而對紫外線敏感，在兩個人使用之間的間隙充分照紫外十分關鍵，能有效阻斷交叉感染。
順便推薦一個Gibco antibiotics antimycotics，很省心。有的人認為不加抗生素能更快發現污染，但還是那句話，不是所有微生物都讓培液渾濁的，大多數都看不出什麼來。
樓上的同學說的很多了，補充一下，細胞污染，尤其是細菌污染，是一個概率性事件，在超凈台外開幾次培養皿不一定會污染，一直小心也會有污染的時候。養成良好習慣的前提下該帶菌操作就要果斷帶菌操作，有自己的判斷最重要。對於拿到結果的細胞及時凍存一批也是有必要的，在長期培養的過程中細胞狀態一直在變化，補實驗時用細胞庫的細胞不一定會有理想的結果就哭了。
現在一大型葯企養細胞做檢測，工作量很大，很多地方都沒辦法非常仔細的做。但是兩年下來只出現過一次污染，總結一下心得：
1、好的潔凈室，空調系統跟得上。
2、好的生物安全櫃，硬體跟的上。
3、瓶子移液器吸頭大都是進口，耗材跟的上。
除了這些就是自己的操作習慣了
4、任何東西不要從敞開的瓶口上面經過。
5、雖然酒精燈會干擾安全櫃氣流但是還是需要一盞用來勤燒瓶口。
6、實驗時所用材料的位置擺放要順手，污染源和已滅菌物品要分開放置。
同樣的實驗做了三年，馬上要辭職了。匿了。
養細胞真的不難，最關鍵幾點：
1、所有的東西使用最好的，如果你用的血清、培養皿、培養基、胰酶什麼的都是進口的，真的很難相信你會把細胞養壞。
2、動作要快，胰酶消化，換液什麼，細胞暴露在空氣中的時間越少越好。另外，要掌握好胰酶消化時間，所謂的細胞狀態差，很多時候是傳代的原因。
3、有時間的話，需要細胞計數，傳相應數目的細胞到培養皿中，可以大致清楚細胞的生長曲線，不會臨時要處理，手足無措。
4、要做什麼心裡要非常清楚，合理安排時間，細胞房的實驗穿插進行，可以節省很多時間，也不會耽誤別人的實驗。
5、個人的實驗器具自己收一套，不要和別人混用，最近換了什麼新的東西稍微記一下，試劑一旦懷疑污染，馬上丟。
6、細胞房不能進去太多人，避免相互干擾。
暫時就寫這麼多吧。
污染方面的話：
0.自己的細胞自己養……血的教訓……
1.在生物安全櫃（或者超凈台），槍頭，血清管，血清，培養基，瓶子都足夠好，並且細胞房有良好的衛生措施（比如隔離服，手套，口罩，清潔，HEPA等等）且不違法操作原則的情況下，你其實很難污染……
2.上述條件不完備的情況下，就要多注意無菌操作了：比如要用的東西提前拿到檯子里照啊（不過這個其實也不大好，因為會擋住紫外線），使用前SDS+酒精擦檯子啊，進出超凈台一定要酒精擦手……
3.少對細胞說話，多靠內心來感動它們（是的！心不誠是不可以的！）至少1天看1次啊
不知道提問者是想得到什麼答案，細胞飼養涵蓋的內容太廣了，而且不同種類細胞的飼養難度以及技術要求不同，腫瘤細胞，成纖維細胞，上皮細胞。。。甚至各類幹細胞。。。每一種都有自己的生長要求。
如果只是單純的一般性操作，大同小異，個人覺得練好技術的情況下注意幾點就好:
1，各種無菌，從培養基到操作過程再到培養箱，時刻注意無菌。本人曾經所在的實驗室出現過大規模污染並最終導致所有細胞集體毀滅。。。教訓慘痛。
2，培養基的配製一定要做好梯度摸索並詳細記錄，否則細胞死都不知道怎麼死的。
3，盡量提高操作熟練度，減少培養皿在培養箱外的滯留時間，細胞很脆弱，經不起折騰，不像人，熱了有空調，冷了能烤火。
4，把握好培養基更換的時間，不同細胞類型時間不同，早了浪費試劑，晚了可能全軍覆沒。
5，經驗很重要，養細胞的很多經驗你是無法在公開的書籍和資料上找到的。多向實驗室前輩學習，他們會讓你少走很多彎路，真的。
養細胞就像打仗，知彼知己，百戰不殆。只有了解你養的對象，才能把他養好。
以上純屬個人觀點，不強加任何人。
主要養人的胚胎幹細胞。
經驗就是如果不想累死盡量別養它。
建議買一本《細胞培養》，這邊也有下載地址：
細胞培養.pdf_免費高速下載
經驗全是用教訓砌起來的。
嚴格的無菌操作是必須的，在此基礎上可能有一些問題容易被忽視。
之所以被忽視，是因為這些問題有時並不影響「正常傳代」。
（1）定期支原體檢測
Zhou Ziliang、PhilWong 都提到了這一點。
有些實驗室並不知道自己培養的細胞中一直存在支原體；或是知道也未採取措施。
這個問題要予以正視並及時解決。
支原體的存在會給你一種
「為什麼轉染/感染以後細胞狀態這麼差？」
「細胞怎麼說死就死？」
「這些黑點點那些黑點點是什麼？」
的體驗。
能做的就是：
a.支原體檢測：其實很難找到一種方法作為檢測支原體存在與否的金標準，可多種方法結合使用。但最常用就是PCR。
b.支原體預防：有添加到培養基中的試劑，有針對工作環境的噴霧，也有設備，等等。
c.支原體的清除：添加到培養基中的針對支原體的抗生素。
（2）培養箱的培養條件
培養箱的培養條件我們通常依賴於面板的顯示，但這還不夠。
能做的就是：
a.檢查培養箱本身及其中隔板是否水平：
對貼壁細胞來說，不水平情況嚴重的話會影響細胞均勻程度和轉染/感染效率。
b.監測過夜不開培養箱後的實際溫度：
放兩個溫度計，最上層一個，最下層一個，過夜，不開玻璃門觀察一下實際溫度。
c.二氧化碳純度/品質的控制：
這個控制很難實現，但可以幫助分析問題。具體純度/品質出了什麼問題，二氧化碳供應商不明說。但實際情況是，細胞面對純度/品質不佳的二氧化碳（可能已經不是二氧化碳了），幾乎停止生長。
生物安全櫃的「安全」建立在幾個基礎上：
a. 操作時，雙手不要頻繁出入安全櫃；
b.操作時，安全櫃里不要堆放太多物品；
c.安全櫃「最安全」的地方在中心區域；
d.紫外燈有壽命，要定期更換。清新O3味，交個朋友吧。呵呵。好順。
請留意華南地區梅雨季節的開始時間。
去過實習，看過細胞傳代。。。。。。。
最重要的是別！污！染！啊！！我去的地方據說有著「最多三天就會渾」的詛咒。。。。
污染太可怕了。。。
經驗來看，有人說絕大部分的污染最終來源是水浴鍋，所以可以把水浴鍋的水倒掉，換成鋁珠，牌子是Lab armor，比較貴。
另外！不要給雜菌指數擴大的機會，一旦發現有污染，從trypsin到培養基全部扔掉，防止一個stock污染所有line，說多了都是淚！！
養細胞細胞這個東西呢有的時候真說不清
養過一段時間的巨噬細胞，一開始操作各種謹慎小心，隨時默念各種無菌原則，培養基什麼的都用的進口的，但細胞就是萎靡不振
兩個多星期過後實在懶得管，換液等操作也很隨意的草草進行，酒精也懶得噴，結果這貨卻開始瘋長，過了幾天居然達到一天要傳一次代，而且數量甚至可以一傳三
你愛細胞，細胞也會愛你的。
難得碰到這麼對口的問題，必須要答一答。
無菌這個要求其實不難，染菌多半是操作問題，手碰了瓶口槍頭之類的。
其實有時候我周末要做實驗，沒有提前紫外照半小時，開風機五分鐘吹一吹，換液傳代之類的小實驗沒出現過污染。
有段時間我單獨使用一個培養箱，出現真菌污染，只能把擋板全卸了，能幹烤的干烤，不能幹烤的用無水乙醇反覆擦拭十遍，就怕孢子藏在縫裡啊，擦完乙醇我都快醉了。。。後來就在水盤裡加新潔爾滅（苯扎溴銨），這個東西比來蘇水好多了，消毒還沒味，老師都找我要點回去給狗消毒。後來箱子給別人用時據說染菌挺嚴重，擋板上五顏六色可漂亮了。
不建議使用酒精燈，過火炙烤並不能滅菌，反而會擾亂超凈台內氣流及增加火災危險。
細胞生長狀態不好時很多人都忍不住經常拿出來看一看，適得其反，頻繁改變細胞環境只會讓細胞狀態更差。
細胞凍存要凍兩管以上，凍存後隔兩天復甦一隻，檢驗凍存效果及污染。
想到什麼再來加吧。
推薦閱讀：